QuDye dsDNA BR Assay Kit, 100 ensaios (incluindo tubos)

O kit de ensaio QuDye dsDNA BR (Ampla faixa) destina-se à quantificação de DNA de fita dupla usando fluorômetro. O reagente QuDye dsDNA BR liga-se seletivamente ao DNA de fita dupla, de modo que qualquer RNA, DNA de fita simples, nucleotídeos livres ou contaminantes proteicos na amostra não alteram os resultados da medição. Outros contaminantes menores, como sais, detergentes e solventes, têm um efeito não significativo nos resultados das medições. Entretanto, recomenda-se minimizá-los ou eliminá-los completamente da amostra.

Todos os reagentes são otimizados para operações com o fluorômetro (todas as suas versões) na faixa de concentrações iniciais de DNA de 100 pg/μL a 1000 ng/μL (a quantidade final de DNA após a diluição da amostra inicial é de 2-1000 ng em 200 μL da amostra de teste). Todas as medições são realizadas em temperatura ambiente; o sinal de fluorescência das amostras é estável por 3 horas.

Para determinar os contaminantes de proteína na amostra de DNA, você pode usar o QuDye dsDNA BR Assay Kit com o QuDye Protein Quantification Kit.

COMPONENTES DO KIT:

INFORMAÇÕES:

Armazenar a +4 °C. Aqueça até +20 °C antes de usar.

Prazo de validade de 12 meses.

❗ Todas as medições com o kit de ensaio QuDye dsDNA BR devem ser realizadas em temperatura ambiente (22-28 °C). Antes de começar, equilibre todas as soluções do kit à temperatura ambiente. Ao usar o kit regularmente, armazene o reagente QuDye dsDNA BR e o tampão QuDye BR em temperatura ambiente, padrões – a +4 °C.

❗ Observe que as flutuações na temperatura da amostra podem afetar significativamente os resultados da medição. Evite aquecer as amostras; particularmente, não segure os tubos de ensaio nas mãos imediatamente antes da medição de fluorescência com um fluorômetro.

❗  Se estiver na câmara do fluorômetro, mesmo que por pouco tempo, o tubo com a amostra fica mais quente, portanto, realize as medições logo após colocar o tubo com a amostra na câmara do fluorômetro. Se uma amostra tiver que ser relida, o tubo com a amostra deve ser removido do fluorômetro logo após a leitura e colocado na câmara do fluorômetro somente quando a fluorescência for medida.

PROTOCOLO:

1- Prepare a solução de trabalho de corante QuDye dsDNA BR levando em conta que serão necessários 200 μL de solução de trabalho de corante para cada amostra e para cada um dos dois padrões. Para isso, dilua 200 × o reagente QuDye dsDNA BR concentrado 200 vezes com o tampão QuDye BR.

• Por exemplo, para medir 3 amostras e 2 padrões, prepare 200 μL x 5 = 1000 μL de solução de trabalho de corante (misture 5 μL de concentrado de reagente QuDye dsDNA BR e 995 μL de tampão QuDye BR).

❗ Recomenda-se usar a solução de trabalho de corante dentro de algumas horas após a preparação. No caso de medições adiadas, proteja a solução de trabalho de corante preparada da luz.

❗ Use somente recipientes de plástico para preparar a solução de trabalho do corante, pois o reagente QuDye dsDNA BR pode ser adsorvido em superfícies de vidro, o que resulta na diminuição da concentração do corante nas amostras e em distorções nos resultados da medição.

2- Prepare dois tubos de 0,5 mL (de paredes finas e transparentes do ponto de vista óptico) para os padrões e um tubo para cada amostra. Coloque etiquetas nas tampas dos tubos. Não rotule a lateral do tubo, pois isso pode interferir na leitura da amostra.

3- Em cada um dos dois tubos para padrões, adicione 190 µL de solução de trabalho do corante QuDye dsDNA BR e 10 µL de padrão quantitativo, 0 ng/µL (Padrão nº 1) ou padrão quantitativo de dsDNA, 100 ng/uL (Padrão nº 2). Agite em vórtice por 2 a 3 segundos e centrifugue rapidamente.

4- Em cada tubo de amostras, adicione 180-199 µL de solução de trabalho do corante QuDye dsDNA BR e 20-1 µL de amostra de teste, respectivamente (o volume total em cada tubo deve ser de 200 µL). Agite em vórtice por 2 a 3 segundos e centrifugue brevemente. Certifique-se de que não se formaram bolhas no tubo. Se necessário, remova as bolhas por centrifugação.

• A diluição da amostra experimental é opcional e depende de sua concentração inicial. A concentração inicial da amostra pode variar de 100 pg/μL a 1000 ng/μL; no entanto, após a diluição com a solução de trabalho do corante QuDye dsDNA BR, a quantidade de DNA deve corresponder à faixa de medição do fluorômetro (2-1000 ng de DNA em 200 μL da amostra de teste).
• Portanto, uma amostra com a concentração inicial mínima aceitável de DNA (100 pg/μL) deve ser diluída 10 vezes para 10 pg/μL [coloque 180 μL de solução de trabalho de corante e 20 μL da amostra (100 pg/μL) no tubo de ensaio, o que corresponde a 2 ng de DNA].
• Uma amostra com a concentração inicial máxima aceitável de DNA (1000 ng/μL) deve ser diluída 200 vezes [coloque 199 μL da solução de trabalho de corante e 1 μL da amostra (1000 ng/μL) no tubo de ensaio, o que corresponde a 1000 ng de DNA].No entanto, evite usar volumes muito pequenos ao diluir a amostra inicial para manter a exatidão e a precisão de suas medições.

5-  Incube todos os tubos (com padrões e amostras de DNA) por 3 a 5 minutos em temperatura ambiente.

6- Realize as medições de fluorescência.