QuDye dsDNA HS Assay Kit, 100 ensaios (incluindo tubos)

O kit é usado para quantificação de dsDNA com o Fluorômetro. O reagente QuDye dsDNA HS liga-se seletivamente ao DNA de fita dupla, de modo que os nucleotídeos, o DNA de fita simples, o RNA, as proteínas e outras impurezas não impedem as medições. Todos os reagentes são otimizados para realizar as medições com o fluorômetro, a faixa de medição das concentrações iniciais de DNA da amostra é de 10 pg/µL a 100 ng/µL.

COMPONENTES DO KIT:

INFORMAÇÕES:

Armazenar a 4 °С. Aqueça até a temperatura ambiente antes de usar.

Prazo de validade de 12 meses.

❗ Todas as medições com o kit de ensaio QuDye dsDNA HS devem ser realizadas em temperatura ambiente (22-28 ° C). Antes de começar, equilibre todas as soluções do kit à temperatura ambiente. Evite aquecer as amostras, pois a temperatura da amostra influencia os resultados da medição; em especial, não segure os tubos de ensaio nas mãos imediatamente antes da medição de fluorescência com um fluorômetro.

PROTOCOLO:

1 – Prepare o tampão 1x TE, levando em conta que serão necessários 200 µL de tampão 1x TE para cada amostra e para cada um dos dois padrões. Para isso, dilua 20x TE concentrado 20 vezes com água deionizada.

2 – Prepare a solução de trabalho de corante QuDye dsDNA HS levando em conta que serão necessários 200 μL de solução de trabalho de corante para cada amostra e para cada um dos dois padrões. Para isso, dilua o reagente QuDye dsDNA HS concentrado 200 vezes com tampão TE 1x.

• Por exemplo, para medir 3 amostras e 2 padrões, prepare 200 μL x 5 = 1000 μL de tampão TE 1x e 1000 μL de solução de trabalho de corante (misture 5 μL de concentrado de reagente QuDye dsDNA HS e 995 μL de tampão TE 1x).

❗ Recomenda-se usar a solução de trabalho de corante dentro de algumas horas após a preparação. No caso de medições adiadas, proteja a solução de trabalho de corante preparada da luz.

❗ Use somente recipientes de plástico para preparar a solução de trabalho do corante, pois o reagente QuDye dsDNA HS pode ser adsorvido em superfícies de vidro, o que resulta na diminuição da concentração do corante nas amostras e em distorções nos resultados da medição.

3 – Prepare dois tubos de 0,5 ml (de paredes finas e transparentes do ponto de vista óptico) para os padrões e um tubo para cada amostra. Coloque etiquetas nas tampas dos tubos. Não rotule a lateral do tubo, pois isso pode interferir na leitura da amostra.

4 – Em cada um dos dois tubos para padrões, adicione 190 µL de solução de trabalho do corante QuDye dsDNA HS e 10 µL de padrão quantitativo, 0 ng/µL (Padrão nº 1) ou padrão quantitativo de dsDNA, 10 ng/µL (Padrão nº 2). Agite em vórtice por 2 a 3 segundos e centrifugue rapidamente.

5 – Em cada tubo de amostras, adicione 180-199 µL de solução de trabalho do corante QuDye dsDNA HS e 20-1 µL de amostra de DNA, respectivamente (o volume total deve ser de 200 µL). Agite em vórtice por 2 a 3 segundos e centrifugue brevemente.

• A diluição da amostra experimental é opcional e depende de sua concentração inicial. A concentração inicial da amostra pode variar de 10 pg/μL a 100 ng/μL; no entanto, após a diluição com a solução de trabalho do corante QuDye dsDNA HS, a quantidade de DNA deve corresponder à faixa de medição do fluorômetro (0,2-100 ng de DNA em 200 μL da amostra de teste).
• Portanto, uma amostra com a concentração inicial mínima aceitável de DNA (10 pg/μL) deve ser diluída 10 vezes para 1 pg/μL [coloque 180 μL de solução de trabalho de corante e 20 μL da amostra (10 pg/μL) no tubo de ensaio, o que corresponde a 0,2 ng de DNA].
• Uma amostra com a concentração inicial máxima aceitável de DNA (100 ng/μL) deve ser diluída 200 vezes [coloque 199 μL de solução de trabalho de corante e 1 μL da amostra (100 ng/μL) no tubo de ensaio, o que corresponde a 100 ng de DNA]. No entanto, evite usar volumes muito pequenos ao diluir a amostra inicial para manter a exatidão e a precisão de suas medições.

6 – Incube todos os tubos (contendo padrões e amostras de DNA) por 3 a 5 minutos em temperatura ambiente.

7 – Realize as medições de fluorescência.