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S1 Nuclease, 100.000 Units

S1 Nuclease, 100.000 Units

R$1.006,32

A nuclease S1 isolada de certas espécies de Neurospora e Aspergillus hidrolisa especificamente ligações fosfodiéster terminais e internas de DNA e RNA de fita simples. A nuclease S1 tem um peso molecular de aproximadamente 34 kDa e existe como um monômero. A faixa de pH ideal é de 4,0 a 4,6, e é ativada por Zn2+ e/ou Ca2+. Os inibidores são EDTA, citrato e altas concentrações de SDS.

≥100.000 a 500.000 unidades por ml

 

Disponível por encomenda

SKU: LS04070 Categoria:

Estabilidade/Armazenamento: Para armazenamento prolongado em solução, por até seis meses, dilua o NUCSI a ≥ 6000 u/ml em água e congele em alíquotas. As soluções diluídas podem ser estabilizadas adicionando 0,1% de albumina (Código Worthington: BSANF) e 10% de glicerol.

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Definição de unidade

Uma unidade hidrolisa um micrograma de DNA desnaturado de timo de bezerro por minuto a 37°C, pH 4,6.

Características da Nuclease, S1

 

Peso molecular

Aproximadamente 32.000 – 36.000 daltons, existe como monômero. (Vogt, V. 1973).

pH ideal

4,0 – 4,6. (Vogt 1973 e Ando 1966).

Ativadores

Zn ++ e/ou Ca ++ . (Vogt 1973 e Ando 1966).

Inibidores

EDTA, citrato (Vogt 1973 e Ando 1966) e uma alta concentração de SDS.

Armazenar

Conservar a -20°C.

 

Ensaio de nuclease S1

Método
Uma unidade é a quantidade de enzima que libera 1µg (0,033 A260) de nucleotídeos solúveis em ácido do DNA desnaturado pelo calor por minuto a 37°C e pH 4,6.
Reagentes

Tampão: 0,2 M NaCl, 0,002 M ZnCl2 , 0,06 M CH3COONa , pH 4,6: dissolver 5,844 g NaCl (PM 58,44), 136 mg ZnCl2 ( PM 136,29) e 1,85 ml de ácido acético glacial concentrado em 450 ml de água destilada de grau reagente. Ajustar o pH para 4,6 com NaOH 10 M. Completar o volume final para 500 ml com água destilada de grau reagente.

Diluente enzimático: dissolver 40 mg de BSA em 200 ml de tampão

Substrato: Triture 60 mg de DNA de timo de bezerro em pequenas fibras e dissolva em 50 ml de água de grau reagente, deixando em temperatura ambiente por pelo menos 18 horas. Pode ser necessária agitação adicional para que a solução se dissolva. Adicione 10 ml da solução de DNA a 10 ml de tampão. Esta é a solução nativa de DNA de timo de bezerro (Substrato B).

Aqueça a solução de DNA restante em um tubo de ensaio Pyrex grande com uma barra de agitação em água fervente, em um aquecedor/agitador, mexendo por 20 minutos. Despeje imediatamente em um béquer de 1 litro PRÉ-CONGELADO em gelo. Misture volumes iguais da solução de DNA e do tampão frio . Esta é uma solução de DNA de timo de bezerro desnaturada pelo calor (Substrato A). Use o mais rápido possível para evitar que o branco se eleve.

Ácido perclórico 15%: adicione 21,5 ml de ácido perclórico concentrado (70%) a 78,5 ml de água deionizada.

Procedimento
  1. Para limpar tubos de vidro (dois para cada ponto), adicione 2 ml de substrato B para testes. Inclua 2 tubos com 2 ml de substrato B para brancos (sem adição de enzima) e 2 tubos com 2 ml de substrato A (teste de DNA nativo).
  2. Incube por 5 minutos antes de adicionar a enzima.
  3. Adicionar 0,1 ml de diluição de enzima
  4. Incube a 37°C por 10 minutos.
  5. Pare a reação adicionando 2 ml de ácido perclórico a 15%.
  6. Deixe no gelo por 10 minutos.
  7. Centrifugue em uma centrífuga de bancada por 15 minutos a 2000 rpm.
  8. Retire 3 ml de sobrenadante e leia A260.

Cálculo

unidades​​​​ml​ = UM260Amostra​​​​​ – UM260Embranco​​​ x diluição x 1 2 4 2​​​​​​​  10

Onde 1242 é um fator derivado da divisão do volume de reação (4,1 ml) pelo A260 de 1 µg (0,033) e da divisão pelo volume da amostra de enzima usada (0,1 ml).

 

Referências de Nuclease, S1

Ando, ​​T.

Uma nuclease específica para DNA desnaturado pelo calor é isolada de um produto de Aspergillus oryzae , 

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Avaliação do uso da nuclease S1 para detectar pequenas variações de comprimento no DNA genômico , 

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Identificação e quantificação específicas de cromossomos de sítios sensíveis à nuclease S1 na cromatina de levedura por eletroforese em gel de campo pulsado , 

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Sondas fluorescentes duplamente marcadas para ensaios de nuclease 5′: purificação e avaliação de desempenho , 

Biotécnicas

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