Carboxipeptidase B Cromatograficamente purificada. Uma solução em cloreto de sódio 100mM. Quimotripsina e tripsina 0,02%. Armazenar a -20°C. REQUER ENVIO ESPECIAL: ICE PACK |
≥170 unidades por mg de proteína |
Carboxypeptidase B, 50 mg
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O CPDB é ativado pela tripsina. O CPDB é altamente específico para lisina e arginina, mas mostra preferência pela arginina (Tan e Eaton 1995). Também pode atuar (em uma taxa mais lenta) sobre valina, leucina, isoleucina, asparagina, glicina e glutamina (Villegas et al. 1995, Nishihira et al. 1995). As diferenças nas especificidades entre carboxipeptidase A (CPDA) e CPDB podem ser atribuídas aos resíduos Ser205, Gly241 e Asp253 em CPDB em comparação com Gly207, Ile243 e Ile255 em CPDA (Coll et al. 1991).
Características moleculares:
Clauser et ai. estudaram o gene da preprocarboxipeptidase B de rato e descobriram que ele é organizado de maneira muito semelhante ao gene CPB1 bovino (Clauser et al. 1988). O gene CPB1 é conservado em muitos eucariotos e foi estudado em humanos, chimpanzés, cães, camundongos, ratos, galinhas, peixes-zebra e moscas da fruta (Avilés e Vendrell 2004). A forma madura de CPDB de rato é homóloga à CPDB bovina (77% idêntica), e os aminoácidos envolvidos na catálise ou na ligação do ligante não apresentam variação. A região de codificação da pré-procarboxipeptidase B consiste em 11 exons (Clauser et al. 1988). Comparações de CPDB de rato, CPDA de rato e CPDA2 de rato genes mostraram que o número, posição e composição da sequência dos exons são conservados, apesar das grandes diferenças nas sequências intervenientes (Gardell et al. 1988, e Clauser et al. 1988). Através do sequenciamento de cDNA e mRNA, o mRNA de CPDB foi determinado como sendo 1385 nucleotídeos, excluindo a cauda poli(A). O mRNA de CPDB de rato é 100 nucleotídeos mais longo que o mRNA de CPDA. Esta diferença é principalmente devido a uma região 3′ não traduzida (UTR) maior no mRNA de CPDB (Han et al. 1986).
Composição:
A principal forma de CPDB é encontrada no estado monomérico. CPDB contém 1 átomo de zinco por mol de proteína. Os resíduos que coordenam o resíduo de zinco são conservados e incluem duas histidinas, um ácido glutâmico e uma água (Avilés e Vendrell 2004).
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As colagenases AFA, AFB e AFC são derivadas de culturas cultivadas em meio completamente desprovido de componentes de origem animal e projetadas para aplicações de bioprocessamento onde a introdução de potenciais patógenos derivados de animais deve ser evitada. Os níveis de proteases secundárias são semelhantes aos tipos 1 e 2 de colagenase.
• CLSAFA é o grau AFA original projetado para ter colagenase e proteases secundárias semelhantes às colagenases dos Tipos 1 e 2.
• CLSAFB contém maiores atividades de colagenase e caseinase do que CLSAFA.
• CLSAFC tem atividade tríptica especialmente baixa semelhante à colagenase tipo 4.• A Worthington também oferece preparações filtradas de 0,22 mícron de cada tipo em forma pré-embalada de 50 mg/frasco para reconstituição direta e uso em todos os procedimentos de isolamento.
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A protease S. aureus, V8 (endoproteinase-Glu-C) cliva especificamente as ligações peptídicas no lado COOH-terminal dos ácidos aspártico ou glutâmico (Drapeau et ai . 1972). Houmard e Drapeau (1972) relatam que na presença de tampões de amônio a especificidade da enzima pode ser limitada a ligações glutamoil. A sua especificidade bastante única, que pode ser considerada oposta à da tripsina, torna-a uma ferramenta útil para a química de proteínas e estudos de mapeamento de péptidos (Cleveland et ai . 1977) e (Hall et ai . 1978).
Peso molecular : 27.000 (Drapeau 1978).
Coeficiente de extinção :
= 4,26 (Houmard 1976).
pH ótimo : 4,0 e 7,8 com substrato de hemoglobina. (Drapeau et ai . 1972).
Inibidores : fluorofosfato de diisopropilo (DFP) e aniões monovalentes tais como F- , Cl- , Br- , CH3COO- e NO3- ( Houmard 1976) .
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A pepsina tem ampla especificidade com preferência por peptídeos contendo ligações com L-aminoácidos aromáticos ou carboxílicos. Ele cliva preferencialmente C-terminal para Phe e Leu e, em menor grau, ligações Glu. A enzima não cliva em Val, Ala ou Gly.
Características moleculares:
A sequência de aminoácidos da pepsina suína foi determinada por Tang et al. (1973) e Moravek e Kostka (1974), e posteriormente confirmado por análise de cDNA por Tsukagoshi et al. (1988) e Lin et al. (1989).
O gene do pepsinogênio A ( PGA ) é dividido entre nove éxons que abrangem aproximadamente 9,4 kb de DNA genômico (Sogawa 1983).
Existem várias versões dos genes PGA encontrados em populações humanas e de chimpanzés, mas as atividades desses vários produtos gênicos são indistinguíveis (Taggart 1985 e Zelle 1988). Em contraste, análises de Southern blot de uma amostragem de porcos sugerem que há apenas um único gene PGA encontrado em todos os porcos (Evers 1988).
A produção de PGA é controlada principalmente ao nível da transcrição (Sogawa et al. 1981 e Ichinose et al. 1988). Em humanos e porcos, verificou-se que o gene PGA está sob controle transcricional específico do tecido, com mRNA detectado apenas na mucosa fúndica gástrica (Ichinose 1991 e Meijerink et al. 1993). A transcrição do gene PGA é regulada por proteínas ativadoras da transcrição que atuam em 3 regiões principais nas regiões promotoras e de iniciação do gene PGA (Meijerink et al. 1993).
Existem quatro proteínas pepsinas relatadas: pepsina A, pepsina B (parapepsina I), pepsina C (gastricsina) e pepsina D (uma versão não fosforilada da pepsina A) (Lee e Ryle 1967). A pepsina A é a protease gástrica predominante; pequenas quantidades das outras pepsinas foram detectadas. As pepsinas B e C compartilham um maior grau de homologia entre si. No cão, B e C compartilham 89% de identidade, A e B compartilham 44% de identidade e A e C compartilham 45% de identidade (calculado com base em Thompson et al. 1994).
Composição:
A pepsina é uma proteína monomérica, de dois domínios, principalmente beta, com alta porcentagem de resíduos ácidos. A pepsina suína tem 4 resíduos básicos e 42 resíduos ácidos e é O -fosforilada em S68 (Tang et al. 1973). Para que a proteína seja ativa, um dos dois resíduos de aspartato no sítio catalítico deve ser protonado e o outro desprotonado. Isso ocorre entre pH 1 e 5, e acima de pH 7 a pepsina é irreversivelmente desnaturada.
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As colagenases brutas são amplamente utilizadas em procedimentos de isolamento de células primárias enzimáticas e dissociação de tecidos. A maioria dos pesquisadores emprega preparações de colagenase bruta como os Tipos 1, 2, 3 e 4 ou colagenase purificada cromatograficamente (Código: CLSPA); este último geralmente combinado com enzimas secundárias como elastase, hialuronidase, etc. Para melhores resultados, a mistura precisa de atividades proteolíticas deve ser adaptada ao tecido a ser dissociado. As correlações entre o tipo e a eficácia com diferentes tecidos têm sido boas, mas não perfeitas, e podem depender parcialmente dos parâmetros de uso e objetivos, bem como das variações de lote para lote. Para obter mais informações, consulte as informações do Programa de Amostragem de Colagenase . Worthington também publica um Guia de Dissociação de Tecidos que fornece informações adicionais sobre as enzimas usadas para essas aplicações e referências específicas para vários tipos de células e tecidos.
Definição da unidade : Uma unidade libera um micromol de equivalentes de L-leucina do colágeno em 5 horas a 37°C, pH 7,5.